Cultura de células

De especialistas para especialistas

Em Life Science: a biologia celular não é tudo, mas sem a biologia celular tudo é nada. Quase toda hipótese científica, por melhor que seja, deve primeiro provar sua validade na menor unidade da vida, a célula. Portanto, a cultura de células tornou-se parte integrante da pesquisa básica e de medicamentos. A elucidação de vias de sinalização complexas, desenvolvimento de medicamentos, estudos de eficácia e toxicidade ou a redução de testes em animais de acordo com os 3Rs? Dificilmente concebível sem modelos de células. A variedade de cepas celulares e sistemas de cultura disponíveis para você agora é enorme. Células primárias e secundárias ou cepas celulares, em suspensão ou aderentes, cultivadas em duas ou três dimensões? A escolha certa é fundamental para o sucesso de seu trabalho científico. O que precisa ser considerado?

Com a SARSTEDT, você tem um parceiro confiável ao seu lado para todas essas questões. Nossos experientes especialistas trabalharão com você para identificar suas necessidades específicas e encontrar a solução ideal a partir de nosso amplo portfólio. Com nossos vasos de cultura, biorreatores, sistemas de armazenamento e filtragem de alta qualidade, temos as ferramentas certas para todas as tarefas. Descubra nossas soluções inovadoras e beneficie-se de nossa experiência em biologia celular.

Células e cepas celulares: Sem dúvida uma boa escolha

A primeira e mais importante pergunta costuma ser: Qual cepa celular é adequada para responder à sua pergunta? Células primárias e cepas celulares secundárias podem ser usadas para essa finalidade.

• As células primárias são isoladas diretamente de tecidos humanos ou animais ou de fluidos corporais. Elas fornecem resultados mais significativos do que as cepas celulares secundárias, pois refletem com precisão as características morfológicas e fisiológicas do tecido do qual foram retiradas. No entanto, o tempo de vida e a proliferação são finitos e lentos, e o cultivo costuma ser mais demorado e complexo.

• As cepas celulares secundárias, como as células HeLa, HEK-293 ou CHO, por outro lado, são capazes de divisão e sobrevivência ilimitadas (imortalizadas). Elas são fáceis de cultivar usando protocolos estabelecidos, dividem-se mais rapidamente e estão disponíveis comercialmente a um custo relativamente baixo. Entretanto, elas reproduzem as propriedades fisiológicas do tecido original com muito menos precisão do que as células primárias.

Depois de selecionar as células ou cepas celulares certas para a sua questão de pesquisa, vale a pena verificar alguns pontos:

• Autenticidade: A cepa celular ou o tipo de célula correto está realmente presente?

• Contaminação: A cultura está livre de micoplasma, vírus, leveduras ou contaminação cruzada de outras células?

• Passagem baixa: As cepas celulares imortalizadas, por exemplo, células tumorais, geralmente apresentam alta instabilidade genética e podem se degenerar após passagens frequentes?

Condições de cultivo: Tudo tem que estar certo!

Independentemente de você estar trabalhando com células primárias ou cepas celulares secundárias, as condições específicas de cultura desempenham um papel decisivo. Isso começa com a seleção do recipiente de cultura ideal Recipientes de cultura .

As células que aderem às superfícies têm necessidades diferentes das células cultivadas em suspensão:

• Recipientes de cultura hidrofílicos oferecem às células aderentes um substrato de cultura ideal. Eles facilitam a adsorção inicial e a adesão subsequente das células.

• Os recipientes de cultura hidrofílicos com grupos polares adicionais facilitam ainda mais a adsorção e a adesão de células primárias ou cepas celulares sensíveis.

• Os vasos de cultura hidrofóbicos, por outro lado, reduzem a adesãodas células em suspensão e as mantêm em solução.

Especialmente com células aderentes, a superfície do recipiente de cultura deve ser absolutamente uniforme para que as células formem uma camada celular uniforme e não se acomodem nas bordas.

Dependendo da aplicação, há diferentes recipientes de cultura disponíveis para essa finalidade:

• Frascos: Para altas contagens de células, alta proteção contra contaminação graças à tampa de rosca

• Bandejas: Para médias contagens de células

• Placas: Para pequenos números de células, por exemplo, em experimentos paralelos

Além do recipiente de cultura correto, os meios de cultura, os fatores ambientais e o fator humano também desempenham um papel decisivo.

Cultura celular tridimensional: perfeitamente redondas!

As culturas de células bidimensionais clássicas são adequadas para muitas questões fundamentais de pesquisa. No entanto, os resultados de uma única camada de células idênticas só podem ser transferidos para um tecido, quanto mais para um órgão ou até mesmo para um organismo inteiro, de maneira muito limitada.

Para chegar o mais próximo possível dessa complexidade, as culturas de esferoides estão desempenhando um papel cada vez mais importante na pesquisa de ciências biológicas:

• Eles formam contatos célula-célula e célula-matriz.

• Elas podem ser compostas por diferentes tipos de células.

• Sua estrutura 3D garante gradientes de nutrientes, oxigênio ou ingredientes ativos.

• Assim, fecham a lacuna entre a situação in vitro e in vivo.

• Podem ajudar a reduzir os testes em animais.

BIOFLOAT^TM: cultura de esferoides rápida e reproduzível

Idealmente, esferoides uniformes podem ser gerados de forma rápida e reprodutível, mesmo quando cepas celulares sofisticadas estão envolvidas. A placa de cultura de células correta pode facilitar consideravelmente o seu trabalho e levar a resultados mensuráveis e melhores.

Graças à sua superfície robusta e altamente antiadesiva, o BIOFLOAT^TM garante que as células aderentes formem preferencialmente contatos célula-célula. Em comparação com outras superfícies antiadesivas, isso significa para sua cultura 3D:

• Formação mais rápida de esferoides após apenas 2 a 24 horas, dependendo da cepa celular

• Maior reprodutibilidade devido aos esferoides redondos e muito uniformes

• Formação confiável de esferoides, mesmo com cepas celulares delicadas

Como uma placa de cultura de células de 96 poços nas dimensões padrãoANSI/SLAS , o BIOFLOAT^TM com essas propriedades é adequado para procedimentos automatizados de alto rendimento, por exemplo, na fase pré-clínica da pesquisa de medicamentos, em estudos toxicológicos e na pesquisa do câncer .

Insertos para cultura de células para experimentos complexos em cultura de células e tecidos

Além da cultura de esferoides, as condições in vivo também podem ser obtidas com o uso de placas de cultura de células e insertos TC correspondentes:

• O sistema de dois compartimentos proporciona às suas células um ambiente semelhante à situação in vivo.

• Os insertos são equipados com uma membrana ultrafina e microporosa que permite a adesão ideal das células.

O sistema de dois compartimentos permite a realização de experimentos complexos, por exemplo, estudos de transporte, secreção e difusão, cocultivo, culturas de células 3D, como modelos organotípicos de pele e muito mais.

Foco nas células: produtos para microscopia celular

Uma película leitosa no fundo do recipiente de cultura, um brilho turvo no meio de cultura da suspensão, nada mais pode ser visto a olho nu. As células de mamíferos medem entre 1 e 30 µm e as células humanas medem, em média, cerca de 25 µm. A condição ou o crescimento de sua cultura celular só pode ser avaliado por microscopia de luz. Outros detalhes, por exemplo, organelas específicas, moléculas de superfície ou a expressão de determinados produtos gênicos, podem ser revelados, após a coloração ou marcação apropriada, usando um microscópio de fluorescência, por exemplo.

A célula da planta de produção: biorreator miniPERM^®

A produção de biomassa ou produtos celulares, como proteínas, de forma eficaz e em grandes quantidades é um desafio em frascos de cultura convencionais. Além de muito trabalho árduo, também requer o espaço necessário na incubadora.

Em vez disso, você pode usar um biorreator que fornece constantemente o meio às células, remove os resíduos metabólicos e garante o maior rendimento possível.

Em escala laboratorial, não queremos apenas um alto rendimento, mas também um manuseio simples. Produção no biorreator miniPERM é ideal para isso.

• Design bem pensado: o módulo de produção de 35 ml é separado do módulo de abastecimento de 400 ml por uma membrana de diálise e, portanto, abastece efetivamente suas células. Seu produto (< 12,5 kD) permanece no módulo de produção.

• Alta densidade celular: é possível obter até 1x10⁷ células/ml, o que corresponde a cerca de 20 frascos de cultura grandes ou três frascos de rolo de 1 litro.

• Troca de gases ideal: a parte externa do módulo de produção consiste em uma membrana de silicone permeável a O₂ e CO₂.

• Versátil: uma grande variedade de células de mamíferos, plantas e insetos pode ser cultivada.

• Economia de espaço e simples: até quatro biorreatores podem ser acomodados na incubadora com economia de espaço usando um dispositivo giratório universal.

Solução de problemas: você pode evitar esses obstáculos

Apesar de todo o cuidado e experiência, às vezes o disafio está nos detalhes. Problemas típicos e como você pode evitá-los:

• Pipetagem: a pipetagem rápida estressa as células e, na pior das hipóteses, elas podem ser destruídas pelas forças de cisalhamento. Ao trocar o meio, a ponteira não deve tocar o fundo do recipiente de cultura para não danificar a camada celular.

• Centrifugação: centrifugue as células apenas pelo tempo e na velocidade necessários para não estressar as células desnecessariamente.

• Crescimento celular circular: isso pode ser causado por vibrações no ambiente. Sua incubadora está ao lado de uma geladeira velha? Seus colegas batem as portas com frequência? O laboratório vizinho está sendo reformado?

• Não há crescimento no centro do poço: se o volume de fluido no poço for muito baixo, o menisco pode empurrar as células para a borda do poço. Se as células se acumularem ali em alta densidade, poderá ocorrer inibição de contato e redução ou ausência de crescimento. Quantidades suficientes de meio de cultura fornecem um remédio.

• Micoplasma: as bactérias que são invisíveis ao microscópio de luz podem prejudicar ou alterar seriamente o crescimento e o metabolismo de suas células. Devido à falta de parede celular, são resistentes a muitos antibióticos usados em laboratório, como penicilina, estreptomicina ou gentamicina. Também passam por filtros estéreis com um tamanho de poro de até 0,2 µm sem nenhum problema. Verificações regulares, por exemplo, com testes baseados em PCR, proporcionam certeza e um método de trabalho estéril reduz o risco.

• Contaminação cruzada e autenticidade: Sua cepa celular é o que você pensa que é? A pergunta é bastante justificada, pois a contaminação cruzada ocorre de fato em laboratórios onde uma grande variedade de cepas celulares é usada. Portanto, vale a pena examinar atentamente a sua própria cultura celular antes e depois de um projeto.

Armazenar corretamente materiais celulares: a conservação criogênica

De onde você geralmente obtém suas células primárias ou cepas celulares? Presumivelmente, do freezer ou, melhor ainda, de um tanque de nitrogênio. A criopreservação é parte integrante da biologia celular, pois muitas cepas celulares são necessárias apenas temporariamente para projetos específicos.

O cultivo permanente não faz sentido por vários motivos. O tempo, os materiais e o espaço na incubadora são mais bem investidos em outro lugar. Além disso, o risco de suas células entrarem em senescência ou desenvolverem alterações genéticas ou morfológicas aumenta a cada passagem adicional. Um banco de células cuidadosamente mantido e armazenado também o protege contra a perda de cepas celulares inteiras em caso de contaminação, falha de equipamento ou erros de manuseio.

Armazenamento celular: (quase) não existe frio demais

Em muitos laboratórios, as células são armazenadas, pelo menos temporariamente, em um freezer de temperatura ultrabaixa a aproximadamente -80 °C. Aparentemente, bastante frio, mas inadequado para o armazenamento de longo prazo de suas células. Isso ocorre porque a formação de gelo intracelular e a recristalização podem levar a uma rápida perda de viabilidade.

Você está seguro com o armazenamento a < -130 °C na fase gasosa do tanque de nitrogênio, mas precisa de um material adequado que possa suportar essas temperaturas. Porque abaixo de -80 °C, os recipientes plásticos convencionais feitos de polipropileno ou policarbonato atingem seus limites.

O material adequado é fornecido pelo sistema de congelamento CryoPure cujos tubos, racks e caixas são especialmente projetados para essas temperaturas.

Para o armazenamento até < -196 °C: os tubos, racks e caixas CryoPure são otimizados para temperaturas extremamente baixas

Ergonômico. fácil abertura da tampa de rosca com apenas uma volta, fácil manuseio graças ao suporte especial, codificação por cores com tampas coloridas e placas de codificação

Filtração em cultura celular: tudo estéril?

A autoclave e a cabine de segurança garantem materiais estéreis e condições de trabalho para seu trabalho de cultura de células. Obviamente, a base da vida de suas células também deve ser a mais estéril possível: o meio de cultura. Entretanto, a esterilização em uma autoclave não é possível para componentes termolábeis. A filtração estéril ainda permite remover com segurança fungos, micoplasma e outras bactérias.

As partículas em suspensão e as partículas maiores geralmente podem ser removidas com um filtro de 0,45 µm, mas um filtro de 0,22 µm deve ser usado para bactérias ou fungos. Se você quiser se proteger contra o micoplasma, é melhor usar um tamanho de poro de apenas 0,1 µm. Devido à falta de parede celular, as pequenas pragas são tão maleáveis que podem passar facilmente por um filtro de 0,2 µm.

Níveis de pureza em cultura celular: trabalhe com segurança!

Tempo, dinheiro, energia, paixão e muita tolerância à frustração: qualquer pessoa que trabalhe com ciência geralmente precisa levar tudo isso consigo. Quase todos os pesquisadores conhecem essa sensação: mesmo à primeira vista no microscópio, fica claro que algo deu errado. As células de fato aderentes se deslocam mortas pelo meio ou cresce algo que não deveria crescer ali.

Tentativas e erros, sucessos e fracassos fazem parte do trabalho científico tanto quanto a pipeta em sua mão ou o microscópio sobre a mesa. No entanto, contratempos desnecessários podem ser evitados observando-se os níveis de pureza dos materiais para o trabalho de cultura de células desde o início.

Vários fatores desempenham um papel aqui:

• Esterilidade: garante que nenhuma bactéria ou fungo viável seja introduzido em sua cultura.

• Livre de pirogênios e endotoxinas: substâncias pró-inflamatórias podem permanecer no material mesmo que não haja bactérias vivas.

• Não citotóxico: para garantir o crescimento vital das células, nenhuma substância citotóxica pode entrar em sua cultura.

• Sem DNA: preserva a autenticidade de sua cepa celular, pois, sob certas condições, o DNA estranho do meio pode ser absorvido pelas células e integrado ao genoma.

• Testado para TC: os produtos com esse grau de pureza não apenas atendem aos requisitos mencionados acima, mas também são livres de DNase e RNase.

Obtenha uma visão geral de nossos graus de pureza e dos graus de pureza e a QUALIDADE SARSTEDT.